PPA—ELISA检测试剂盒在猪瘟抗体临床监测中的应用

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[ 更新时间：2013-09-13 ]

PPA—ELISA检测试剂盒在猪瘟抗体临床监测中的应用

近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，转变为隐性感染和亚临床感染，临床表现也更加复杂，既有区域性流行，又有零星散发，既有高死亡率的急性症状，又有持续感染的温和性症状，出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟’’和“带毒母猪综合征”，病理剖检也常常不同于典型猪瘟的病理变化，给兽医临床诊断带来很大困难。尽管血清学抗体检测方法很难有效区分疫苗毒与野毒产生的抗体，但由于其具有使用方便、一次检测量大和血清容易保存等优点而被广泛应用，在猪瘟流行状态监测和流行病学调查等方面有着重要作用，也是免疫猪群抗体水平监测的主要方法，对疫苗免疫效果评价及免疫程序的制定均具有重要意。本研究应用猪瘟病毒PPA—ELISA抗体检测试剂盒对436份免疫猪血清样品进行检测，旨在了解猪瘟的疫苗免疫效果，合理指导猪瘟的防疫，为猪瘟的综合防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2012年3一l2月山东滨州预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室采集山东、河南、河北等地免疫猪临床血样共436份，按常规方法分离血清并编号，-20℃保存备用。猪瘟病毒PPA—ELISA抗体检测试剂盒121由本实验室制备并保存。ELX800一酶标仪、37℃恒温培养箱、8道移液器。

1.2 间接EUSA检测步骤及结果判定

1)在A1和A2孔中分别加入试剂盒中的100 uL阴性对照血清；

2)在A3和A4孔中分别加入试剂盒中的100 L阳性对照血清；

3)将分离的临床血清1：100稀释后，取100 L加入相应孔中，并做好记录；

4)37℃孵育1 h；

5)将各孔的废液弃入废液桶，将试剂盒内20x浓缩洗涤液用蒸馏水稀释成1 X洗涤液后每孔加入约300 L进行洗板，重复5次，每次2～3 min；

6)将试剂盒内lOx酶标抗体用蒸馏水稀释成l×酶标抗体后，每孔加入100 L；

7)37℃孵育1 h；

8)重复步骤5)；

9)每孔加入试剂盒中的底物溶液100 L；

10)室温避光孵育5 min；

l1)每孔加入试剂盒中的终止液50 L；

12)在酶标仪的450 nm波长处测定各孔的吸光度值，即0D 值。当阴性对照血清的0D45o值≤0.2、阳性对照血清的0D45o值I>0．4时，试验结果成立，记录各检测样品的OD45o值，计算各检测样品的S／P值。当样品S／P值≥0．282时判为阳性，当S／P值<0．231时判为阴性，当0．231≤S／P值<0．282时判为可疑。对可疑样品须重新检测，重检时，S／P值I>0．231为阳性。

2 结果

本试验阴性对照血清的0D45o值分别为0．105和0．107(取均值0．106)，阳性对照血清的OD45o值分别为1．115和1．121(取均值1．118)，符合阴性对照血清0D45o值≤0．2、阳性对照血清0D45o值>10．4的要求，试验结果成立。根据S／P值计算公式，计算得到阳性样品376份、阴性样品35份、可疑样品25份。对25份可疑样品重新检测，得到阳性样品18份、阴性样品7份。436份检测样品共计得到阳性样品394份、阴性样品42份，阳性率为90．4％(394／436)。

3 讨论

猪瘟的诊断方法很多，主要包括病毒的分离与鉴定、血清学方法及分子生物学检测方法。其中，血清学方法是检测猪瘟血清抗体的重要手段之一。ELISA诊断方法具有敏感性和特异性强、操作简单、检测快速、重复性好、高通量、无辐射、价格低廉等特点，在病毒学、免疫学、血清学、寄生虫学、细菌学等领域得到了广泛应用，是当前动物传染病检疫、流行病学调查和免疫监测广泛采用的血清学诊断技术[21。因此，笔者选择PPA—ELISA抗体检测试剂盒对猪瘟免疫后的抗体水平进行监测，结果发现，猪瘟的平均抗体阳性率高达90．4％，远远高于我国农业部要求的猪瘟平均抗体阳性率75％的标准，说明我国现行猪瘟疫苗免疫效果较好，但仍存在个别猪场免疫失败的现象。本试验中抗体水平不达标的猪场收到检测结果后，对免疫失败猪及时重新免疫。本试验结果显示，猪瘟病毒PPA—ELISA抗体检测试剂盒操作简单、敏感、特异、检测快速、高通量，非常适用于猪场免疫后的抗体水平监测。