食品中呋喃妥因代谢物酶联免疫检测试剂盒的研制

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[ 更新时间：2013-08-19 ]

食品中呋喃妥因代谢物酶联免疫检测试剂盒的研制

摘要：目的开发研制快速检测呋喃妥因代谢物的酶联免疫检测试剂盒。方法：依据直接竞争ELISA原理，采用包被法确定最佳抗体包被浓度和酶标抗原工作浓度、包被条件、反应时间、底物显色时间等，并对试剂盒的各项技术指标进行确认。结果：成功的组装了呋喃妥因的酶联免疫检测试剂盒，并建立了肌肉、肝脏、水产、蜂蜜等的前处理方法，检测限均远低于lug／kg。该试剂盒线性检测范围为0～4．05ng／mL，IC₅₀浮动范围0．30～0．60ng／mL，样品的板内、批内、批间的变异系数均小于15％，平均回收率在65％～90％之问，与其同类药物的交叉反应率均小于0.2%。结论：本研究研制的试刺盒重复性、再现性、特异性、稳定性各项指标均符合技术要求，可用于动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留的检测。

关键词：食品；呋喃妥因；酶联免疫

呋喃妥因(Nitrofurantoin)以及呋喃唑酮(Furazolidone)、呋喃它酮Furaltadone)、呋喃西林(Nitrofurazone)等硝基呋喃类抗生素因其广谱、高效、廉价等特点被广泛应用于家畜、家禽、水产、蜂等动物传染疾病的预防和治疗。硝基呋喃类药物在动物体内很快代谢，1一氨基一乙内酰脲(AHD)是呋喃妥因的代谢物，其内服后随尿液大量排出，临床上主要用于敏感菌所致的泌尿系统感染，但此类药物及其代谢物具有很强的毒性，其在动物源性食品中的残留可以通过食物链传递给人类，长期摄入有致畸胎、致癌等副作用。美国、日本和欧盟目前已全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。我国农业部文件农牧发[200211号也规定动物源性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮的检出限为不得检出。

目前用于检测硝基呋喃类抗生素代谢物残留的方法主要有HPLC、LC—M/MS和酶联免疫法(EUSA)等。其中HPLC和LC—MS/MS灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法，在我国LC—MS/MS技术更是被作为此类药物在动物源性食品中检测的国标法。然此类方法对仪器和操作人员要求都较高，一个样品检测要几百元，检测时间也很长，不能

满足现场抽检的需求和推广应用。ELISA技术以其快速、灵敏、特异性高等特点已成为目前药品残留检测的有效方法之一。应用酶联免疫技术检测硝基呋喃类抗生素及其代谢物残

留近几年来取得了少许成果，Chang C等采用ELISA测定可食性动物组织中呋喃唑酮代谢物，抑制率(Ic )可达到0．91mg／L，回收率55．8％～99．6％；虾类中喃唑酮代谢物残留ELISA筛选方法。他们在酸性条件下利用2一硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，正己烷去杂质后进行ELISA分析。其最低检测限为0．3tLg／kg，向样品中添加浓度为0．5、1．0和3．01xg/kg 3个梯度标准品溶液时，平均回收2率范围为90．7％～95．9％。目前，国外也已经开发出检测呋喃妥因等代谢物的ELISA商品化试剂盒。但其价格昂贵，价格均在4000元，盒以上。国产呋喃妥因残留检测试剂盒质量和性能都不够稳定，市场化范围qE4",。本研究拟采用酶联免疫一步分析法，研制出可以在短时间内大量定量分析检测水产、蜂蜜、畜禽等生物样本中AHD的试剂盒。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器AHD等标准品(Sigma公司，纯度>99％)；HRP购自美国IDS公司；TECAN Genios Basic酶标仪；样品稀释工作液；ELISA试剂(包被液、封闭液、酶标记物稀释液、终止液、浓缩洗涤液)；其它化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 AHD抗血清效价的测定呋喃妥因抗血清采购自美国IDS公司。采用直接ELISA法进行测定。酶标反应板包被抗呋喃妥因抗血清、洗涤、封闭，并以同样的稀释度的阴性血清为对照，第1行1～12孔依次加入倍比稀释的呋喃妥因过氧化合物酶结合物(购自美国IDS公司)，均为IO0uL／孔，22～23℃温育10min；再加入辣根过氧化物酶(ARP)底物(购自美国

IDS公司)lO01~ld孔，经过10min孵育，终止反应后测定OD₄₅₀值。抗血清的OD₄₅₀值与相同稀释度的阴性血清0D₄₅₀值之比大于2的最大稀释度定为呋喃妥因抗血清的效价。

1.2.2 EUSA方法的建立呋喃妥因抗血清的效价确定之后，依次通过对半抑制浓度(IC )值、最大吸光度值进行比较确定最佳抗体包被浓度和酶标抗原工作浓度、包被条件、反应时间、底物显色时间等。以AHD浓度( g／L)的自然对数值为x轴，百分吸光率B／BO(B为添加药物时的吸光值，B0为不添加药物时的吸光值)为Y轴，绘制曲线图。

1.2.3 AHD标准曲线的建立根据1.2.2节得到的最佳ELISA方法条件，选择合适的抗原抗体含量及不同浓度梯度的AHD标准品(O、0．05、0．15、0．45、1．35、4．05ppb)进行一步

法直接竞争ELISA，以AHD标准品浓度(ng／mL)的自然对数值为x轴，百分吸光率B／B0为Y轴，得到线性及灵敏度较高的呋喃妥因标准曲线。

1.2.4 样品前处理方法的建立对于组织(肌肉、肝脏、水产等)取适量供试样用均质器均质样本，避免出现有高脂肪、血管等物质，取1．0±0．05g的均质物进行以下操作；对于蜂蜜样品直接称取1．0±O．05g的供试样进行一下操作：

(1)衍生化

加人4mL蒸馏水，0．5mL 1M 盐酸和150 L 50mM的4一硝基苯甲醛溶液；涡旋混匀30s，60％水浴3h，每隔1h涡旋振荡一次。

(2)提取

加人5mL 0．1M 磷酸氢二钾和0．4mL 1M氢氧化钠溶液，混匀加入6mL乙酸乙酯，剧烈振荡60s以上；室温条件下，4000g离心10rain；收集3mL的上层乙酸乙酯至10mL玻璃试管(不能使用塑料管)，50～60％水浴氮气吹干。

(3)净化

加人lmL正己烷，涡旋混匀30s，然后加入lmL样品稀释工作液复溶，振荡混匀30s(组织样本此过程中一定要注意防止乳化)；室温条件下3000g离心5min完全弃去上层有机相，取下层水相取50 L用于分析。对于饲料样品，称取1．0±0．05g粉碎的样本加入lOmL乙腈，65℃超声波提取15min，室温下4000rpm离心10min；取上清液2mL，于50～60％水浴环境中氮气吹干；加入lmL样品稀释工作液溶解干燥物。充分混匀后用样品稀释工作液再做1O倍稀释，取50 L用于分析。

1.2.5 试剂盒各项技术参数的确定

(1) 试剂盒灵敏度实验

评价竞争性酶联免疫吸附实验反应灵敏度的方法，常用的有Ic 和检测限(下限)。分别测定20次标准曲线的Ic,确定该值的浮动范围。一定条件下，试剂盒方法检测限符合

正态分布的规律，取肌肉、肝脏、水产、蜂蜜20个空白样本通过试剂盒测定的光密度在标准曲线上对应的AHD含量的平均值(x)和标准差(s)表示，检测限=X+3S。

(2) 试剂盒重复性和再珊I生实验

重复性即实验室内的变异程度。以蜂蜜样品为例，将空白样品以定量限0．5 g／kg、两倍定量限1 g／kg进行添加，每个浓度各5个平行，并抽取3批试剂盒，每批试剂盒测定

同一份样品3次，分别计算测定样品板内、批内和批间平均回收率，得到样品的变异系数和回收率范围。再现性即实验室间的变异程度。对同一鱼肉样品，分别在不同地点的实验室对随机抽取的同一批次的3个试剂盒进行添加实验，计算其平均回收率和变异系数。

(3) 试剂盒特异性实验

试剂盒的特异性可用药物的交叉反应率来表示。交叉反应率即引起50％抑制的标准物浓度与类似物引起50％抑制的浓度值之比。本实验分别测定了该试剂盒与呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等原型药及其代谢物的交叉反应率。

(4) 试剂盒稳定性实验

采用冷热性加速实验确定试剂盒的稳定性。将三批试剂盒置于37℃恒温箱中1d、3d、6d，随机取6盒试剂盒检测相关技术指标。从3批试剂盒中抽出6个试剂盒，每盒均做4℃ 6个时间段(第0、1、2、3、6、7月)的保存试验。每个时间点分别取出1个试剂盒，每个试剂盒做5条曲线、5个样品重复，测定其Ic 抑制浓度(灵敏度)、检测限、标准品板内变

异系数和回收率等相关技术指标。

2 结果

2.1 AHD抗血清效价的确定经测定AHD抗血清的效价为1000。

2.2 AHD抗体包被浓度和酶标抗原工作浓度的确定通过滴定法对Ic 值、最大吸光度值和样品添加回收率的比较，确定抗体的包被浓度和酶标抗原的工作浓度。

随着包被抗AHD抗血清浓度的降低，最大吸光值降低，Ic 值在一定范围内也随之降低。经测定包被抗血清按1.50×10 倍稀释，其Ic 浓度、回收率和吸光度值均较好。因此，选择1.5 x 10 倍稀释的包被抗血清进行包被。AHD酶标物在2.5×10 倍稀释时，最大吸光度值、IC 一直浓度和样品测定结果均处于最佳状态。3.0 x 10，倍稀释时，吸光度降低以及本底干扰增加。所以酶标抗原浓度选择以试验研究2500倍稀释相对较好。

2.3 包被条件的确定用包被液将抗AHD抗血清稀释至最适工作浓度，每孔100It,L，分成3组。第一组：37℃温育lh；第二组：37。c温育2h；第三组：4℃温育24h。综合3组数据结果，选择最大吸光值较大，Ic 较低，添加回收率较高的包被条件作为试剂盒的包被条件；37％温育2h，最大吸光值和IC 比较好，故选择该包被条件。

2.4 反应时间的确定加入标准品溶液和酶标抗原溶液后分另拥10min，30min，60min，结果见表5。样品与酶枥就原与抗血清反应时间为30min后，样品中的AHD能充分与酶标抗原竞争结合酶标板上的已包被的抗血清的有效位点，再加入底物显色液，可以提高反应的灵敏度并且最大吸光度值也比较好；而反应lOmin，加人底物显色液，其吸光值较低，易出现样品测定结果不准确现象；其次反应60min，最大吸光值偏高。

2.5 底物显色时间的确定加入底物溶液后，22 23％条件下显色5min、10min、20min。底物液显色时间若较短(5min)，则吸光值较低，对加终止液的时间要求更短，否则会出现实际值与真实值直接的差异。20min，吸光度值较高，对Ic 有轻微影响，且增加了整个操作时间。显色10min，曲线和实际样品测定均符合要求。其吸光度值域Ic 值均较好，故选用其作为试剂盒的显色反应时间。

2.6 试剂盒的组装经反复实验，成功组装了AHD一步法ELISA试剂盒，包括：酶标板1块(12条X 8孔，可拆分)；酶标物1瓶(浓缩液10 X：1．2mL)；酶标物稀释液1瓶(13mL)；样品稀释液5×1瓶(4OraL)；清洗液10 X l瓶(50mL)；显色剂1瓶(13mL)；终止液1瓶(13mL)；AHD标准品6 x lmL/管(Ong/mL，0.05ng/mL，0.15 ng/mL，0.45 ng/mL，1.35 ng/mL，4．05 ng/mL)；4一硝基苯甲醛75.5mg。

2.7 试剂金各项技术参数的确定

2.7.1 试剂盒灵敏度的确定统计Ic 二十次测定结果，Ic₅₀ 平均值为0.47ng/mL，浮动范围在0.30—0.60ng/mL之间。经试验确定样品中AHD代谢物最低检出限为0．3ug/kg(组织样品)；样本中原型药最低检测限为5Oug/kg(饲料)。该检测限能满足欧盟的1ug/kg的最低检测限量的要求。

2.7.2 试剂盒重复性和再现性的确定对蜂蜜样1.0 ug/kg、2.0 ug/kg两个浓度的AHD进行添加，测定变异系数，样品的板内变异系数为1.7％～9.86％之间，批内、批间变异系数均小于15％，样品的平均回收率在65％一90％之间。对同一鱼肉样品，分别在不同地点的实验室对随机抽取的同一批次的3个试剂盒进行添加实验，计算得到的加标平均回收率分别为88％、76％和85％，板问、批内和批间变异系数均小于15％，说明此试剂盒再现性良好。

2.7.3 试剂盒特异性的确定本试剂盒检测结果显示，AHD与其同类的呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林等及其代谢物的交叉反应率均小于0．2％。表明该试剂盒适用于食品中呋喃

妥因类药物的残留检测，具有良好的特异性。

2.7.4 试剂盒稳定性的确定冷热稳定性实验结果显示：该试剂盒在37℃经6d的保存试验，OD值有所下降，但零标准吸光度值仍在1.0以上。Ic 均在0.30～0.60ng/mL之间，阳

性回收率在67.7％一102.7％；标准品板内变异系数在15％以下。试剂盒保存条件为2—8℃ ，经过近7个月的测定，发现试剂盒从生产之起到第6个月，各项指标均符合《农业部文件》农医发r[2oo5] 17号附件2试剂盒备案参考评判标准的规定。到第7个月时检测结果发现0标准吸光度值在1.4左右，阳性样品回收率有下降趋势但幅度不是很大。

3 讨论

本研究针对呋喃妥因代谢物(AHD)，依据一步法直接竞争性ELISA原理，在组装试剂盒时，采用棋盘法确定最佳抗体包被浓度和酶标抗原工作浓度，选着合适的抗原抗体反应缓冲液，从而达到了很好的竞争抑制效果。本研究建立了肌肉、肝脏、水产、蜂蜜等的前处理方法，检测限均远低于lug/kg。线性检测范围为0～4.05ng／mL，IC₅₀平均值浮动范围在0.30～0.60ng／mL之间，样品的板内变异系数为1．7％～9.86％之间，批内、批间变异系数均小于15％，样品的平均回收率在65％～90％之间，与其同类药物的交叉反应率均小于0.2％，重复性、再现性、特异性、稳定性各项指标均符合要求。

综上所述，本研究建立的呋喃妥因及其代谢物直接竞争ELISA检测试剂盒各项技术指标均符合要求，本试剂盒操作简便、灵敏度高、稳定性好、检测时间短，适用于大量样品中呋喃妥因残留检测的快速筛选，为食品中非法添加呋喃妥因造成的食品安全问题提供了可靠的技术保障。

本文内容摘自于“畜牧兽医科技信息试验研究”2012年第7期