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层析
[ 更新时间:2014-06-18 ]
层析(chromatography)是“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同,将多组分
混合物
进行分离及测定的方法。有
吸附层析
、
分配层析
两种。一般用于有机
化合物
、
金属离子
、氨基酸等的分析。层析利用物质在
固定相
与
流动相
之间不同的分配比例,达到分离目的的技术。层析对
生物大分子
如蛋白质和核酸等复杂的有机物的
混合物
的分离分析有极高的分辨力。
1
语源学
编辑
chroma意为“色彩”,graphy源自希腊文,意为“写”。
色谱
为层析的同义语,都是从英语chromatography译来
的。
层析(
色谱
) chromatography
在把微细分散的
固体
或是附着于固体表面的液体作为
固定相
,把液体(与上述液体不相混合的)或气体作为移动相的系统中,使试料
混合物
中的各成分边保持向两相分布的
平衡状态
边移动,利用各成分对固定相
亲和
力不同所引起的移动速度差,将它们彼此分离开的定性与
定量分析方法
,称为层析,亦称
色谱法
。根据移动相种类的不同,分为液体层析、气体层析二种。用作
固定相
的有
矽胶
、
活性炭
、
氧化铝
、
离子交换
树脂、离子交换纤维等,或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体,也可使用其他物质。将作为
固定相
的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为
柱层析
(column chromatogra-phy),在
玻璃
板上涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析(thin-layer chromatography),后者可与用
滤纸
作为固定相的
纸上层析
进行同样的分析,即在固定相的一端,点上微量试料,在密闭容器中,使移动相(液体)从此端渗入,移动接近另一端。通过这种展开操作,各成分呈斑点状移动到各自的位置上,再根据Rf值的测定进行鉴定。当斑点不易为肉眼观察时,可利用适当的
显色剂
,或通过紫外灯下产生
荧光
的方法进行观察。也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开(这时的展开方向应与原方向垂直),使各成分分离完全的双向层析(two-dimensional chromatography)。分离后,将斑点位置的
固定相
切取下来,把其中含有来自试料的物质提取进行定量分析。但为制备与定量,
柱层析
则更为适宜。在
柱层析
中,移动相从加入试料的一端展开到达另一端后,继续展开使各成分和移动相一起向柱外分别溶出,这就是广泛使用的所谓洗提层析(elution chromatography)。层析根据固定相与
溶质
(试料)间
亲和
力的差异分为吸附型、分配型、
离子交换
型(
离子交换层析
)等三种类型。但这并不是很严格的,有时常见到其中间类型。此外,近来也应用
亲和
层析,即将与
基质
类似的
化合物
(通常为
共价键
)结合到
固定相
上,再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
2
类别
编辑
◆按层析的机理划分:
吸附层析
、
分配层析
、
离子交换层析
、
凝胶过滤层析
、
亲和
层析等。
吸附层析
:利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异,达到分离鉴定的目的。
分配层析
:利用不同组分在
流动相
和
固定相
之间的
分配系数
不同,使之分离。
离子交换层析
:利用不同组分对
离子交换剂
亲和
力的不同。
凝胶层析
:利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
◆按
流动相
与
固定相
的不同划分:
气相层析、
液相层析
。这两大类层析是以
流动相
不同来划分的。如同时区分
流动相
和
固定相
,划分为:
气固层析
、
气液层析
、
液固层析
和
液液层析
等。
◆按操作形式划分:
柱层析
、纸层析、薄层层析、高效
液相层析
等。
柱层析
:将
固定相
装于柱内,使样品沿一个方向移动而达到分离。
纸层析:用
滤纸
做
液体
的载体,点样后,用
流动相
展开,以达到分离鉴定的目的。
薄层层析:将适当粒度的吸附剂铺成薄层,以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
以上划分无严格界限,有些名称相互交叉,如
亲和
层析应属于一种特殊的
吸附层析
,纸层析是一种
分配层析
,
柱层析
可做各种层析。
3
基本原理
编辑
层析须在两相系统间进行。一相是
固定相
,需支持物,是固体或液体。另一相为
流动相
,是液体或气体。当
流动相
流经
固定相
时,被分离物质在两相间的分配,由
平衡状态
到失去平衡到又恢复平衡,即不断经历吸附和解吸的过程。随着
流动相
不断向前流动,被分离物质间出现向前移动的速率差异,由开始的单一区带逐渐分离出许多区带,这个过程叫展层。
系数K是物质在两相中的浓度比。K值大,则在
固定相
中吸附牢,K值小吸附差。各物质间的K值差别大,则易被分离。不同类型层析的K值含义不同,可视为吸附平衡常数,
分配常数
或
离子交换
常数等。
研究层析现象而发展的
塔板理论
,与有机化学实验中的
分馏法
原理有些相似。被分馏的有机
溶剂
在
分馏柱
内的填充物上形成许多热交换层,从而把低沸点溶剂先分馏出来,达到纯化的目的。在层析时用
理论塔板数
n来衡量层析效能。
tR为物质在
层析柱
上的保留时间,W为洗脱下来的物质峰形的宽度。n值愈大表示
层析柱
的效能愈高。如用
理论塔板高度
H表示,则包含了
层析柱
长度的因子。
式中L为
层析柱
的柱长。H值越大,则柱效越低。
此外影响层析分离效果的还有
涡流扩散
、
纵向扩散
和传质
阻抗
等因素。因此选择层析
固定相
支持物的粒度、均匀度等物理性能,
流动相
的层析系统和温度等都是做好层析的关键。
4
常用层析
编辑
◆
吸附层析
吸附剂的吸附力强弱,是由能否有效地接受或供给
电子
,或提供和接受活泼氢来决定。被吸附物的
化学结构
如与吸附剂有相似的
电子
特性,吸附就更牢固。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为:
活性炭
、
氧化铝
、硅胶、氧化镁、
碳酸钙
、
磷酸钙
、石膏、纤维素、
淀粉
和糖等。以
活性炭
的吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附剂遇水即钝化,因此
吸附层析
大多用于能溶于
有机溶剂
的有机
化合物
的分离,较少用于无机化合物。洗脱
溶剂
的解析能力的强弱顺序是:醋酸、水、甲醇、乙醇、
丙酮
、
乙酸乙酯
、醚、氯仿、苯、
四氯化碳
和
己烷
等。为了能得到较好的分离效果,常用两种或数种不同强度的
溶剂
按一定比例混合,得到合适洗脱能力的溶剂系统,以获得最佳分离效果。
◆
分配层析
在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是
水相
和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等,这些亲水物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解,但分配比率不同,展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。
◆
离子交换层析
支持物是人工交联的带有能解离
基团
的有机
高分子
,如
离子交换树脂
、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带
阳离子
基团
的,如磺酸基(—SO3H)、羧甲基(—CH2COOH)和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的,如DEAE—(
二乙基胺
乙基)和QAE—(四级胺乙基)等为阴离子交换剂。
离子交换层析
只适用于能在水中解离的
化合物
,包括有机物和
无机物
。对于蛋白质、
核酸
、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在
水溶液
中解离后,能吸引水中被分离物的离子,各种物质在
离子交换剂
上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持
平衡状态
,各种离子有不同的交换常数,K值愈高,被吸附愈牢。洗脱时,增加溶液的
离子强度
,如改变pH,增加盐浓度,离子被取代而解吸下来。洗脱过程中,按K值不同,分成不同的区带。
◆
凝胶过滤层析
支持物是人工合成的交联高聚物,在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层,凝胶周围的水为外水层。控制
交联度
以形成不同
孔径
的
网状结构
。
交联度
小的
孔径
大,交联度大的孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于
孔径
的分子进入,大于孔径的分子被排斥在外水层,最先被洗脱下来。而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。选择不同规格的凝胶,可把一个
混合物
按分子量的差异分成不同的组分。这种方法曾被称为分子筛。目前常用的凝胶商品有:
葡聚糖
凝胶(sephadex)、
聚丙烯酰胺
凝胶(bio-gel)、
琼脂糖
凝胶(sepharose)和
聚苯乙烯
凝胶(styragel)等。
◆
亲和层析
在一对有专一的相互作用的物质中,把其中之一联结在支持物上,用于纯化相对的另一物质。常见的
亲和
对如:
酶
和抑制剂,抗原和抗体,
激素
和
受体
等。支持物为琼脂糖或纤维素等。
◆
气相层析
属于
分配层析
或
吸附层析
,仅适用于分析分离
挥发
性和低挥发性物质。
固定相
是在
惰性
支持物(如磨细的
耐火砖
)上覆盖一层高沸点液体,如硅油、高沸点
石蜡
和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20%。分析时操作温度范围,一般从
室温
到200℃。特殊的
层析柱
能达到500℃。
流动相
常用氦、氩或氮为展层气体。气相层析分离的区带十分清晰,是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡,所需分析时间大为缩短,一般为数分钟至10余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果,因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、
灵敏
和微量的优点。气相层析也能用于分离制备样品,但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的
装置
。
◆
纸层析
以
滤纸
为支持物的
分配层析
。组成滤纸的
纤维素
是亲水物质,能形成
水相
和展层
溶剂
的两相系统,被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的
混合物
时可做单向层析。对于复杂的混合物,可做
双向层析
。1944年A.J.P.
马丁
第一次用纸层析分析氨基酸,得到很好的分离效果,开创了近代层析的发展和应用的新局面。70年代以后,纸层析已逐渐为其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法,如
离子交换层析
、薄层层析、高效
液相层析
等所代替。
◆
薄层层析
在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约1~2毫米的支持物,如纤维素、
硅胶
、
离子交换剂
、氧化铝或
聚酰胺
等,根据需要做不同类型的层析。
聚酰胺薄膜
是一种特异的薄层,将
尼龙
溶解于浓甲酸中,涂在
涤纶
片基上,当甲酸挥发后,在涤纶片基上形成一层多孔的薄膜,其分辨力超过了用尼龙粉铺成的薄层。薄层层析较纸层析优越在于分辨高,展层时间短。例如用纸层析做
氨基酸分析
,往往需要两天时间,而且对层析条件要求严格,不易得到满意的分离效果。如用薄层层析做,一般约需半小时,分离效果更好。薄层层析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制备样品。
◆
高效液相层析
(又名
高压液相色谱
)
70年代新发展的层析法。其特点是:用
高压
输液泵,压强最高可达5000psi(相当于34个
标准大气压
)。用直径约3~10微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一层1~2微米的
二氧化硅
,经
硫酰氯
反应生成Si—Cl,进一步连接疏水的烷基,如Si—C18H37,或阳离子交换基团—Si(CH2)n—C6H4SO3H,或
阴离子交换
基团—Si(CH2)nNH2。这种支持物能承受很高的压力,化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC,可做
吸附层析
、
离子交换层析
和
凝胶过滤层析
。其分析微量化可达10-10克水平。但用于制备,可以纯化上克的
样品
。展层时间短,一般需几分钟到10余分钟。其分析速度、
精确度
可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥发和
极性
物质。而气相层析只适用于
挥发性
物质,两者互为补充,都是目前最为理想的层析法。HPLC配有程序控制洗脱
溶剂
的梯度混合仪,数据处理的积分仪和记录仪等
电子系统
,成为一种先进的分析仪器,在
生物化学
、化学、医药学和
环境科学
的研究中发挥了重要作用。
◆
反相层析
在
吸附层析
中,高极性物质在
层析柱
上吸附较牢,洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的
烷烃
类,洗脱液用极性强的
溶剂
,如
甲醇
和水的
混合物
。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附,最先洗下来,得到较好的分离效果。这种层析法与普通的
吸附层析法
相反,故称为反相层析。目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱,即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团。
◆
同系层析
在
核酸
分析中,将样品经
核酸酶
部分裂解成不同长度的
核苷酸
片段,用
同位素
标记后,在DEAE纤维素薄层上分离,用含有未标记的相同的核苷酸片段作展层
溶剂
,这样,未标记的核苷酸把标记过的核苷酸推进,使按分子量大小不同把标记核苷酸片段,按由小到大的次序排列,达到分离的目的。于是把这种层析法称为同系层析。同系层析和电泳相结合曾用于寡核苷酸的顺序分析。
纸层析是层析法的一种,要了解纸层法还得从层析法开始.层析法又称色层分析法或
色谱法
(Chromatography),是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同,使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如:我们利用物质在
溶解度
、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及
离子交换
、
亲和
力的大小及特异的生物学反应等方面的差异,使其在
流动相
与
固定相
之间的分配系数(或称
分配常数
)不同,达到彼此分离的目的。
层析法的最大特点是
分离效率
高,它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定,又可用于大量物质的
分离纯化
制备。因此,作为一种重要的分析分离手段与方法,它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在,它在石油、
化工
、医药卫生、生物科学、
环境科学
、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。
层析根据
固定相
基质的形式分类,层析可以分为纸层析、薄层层析和
柱层析
。其中纸层析是指以
滤纸
作为基质的层析。
5
层析发展
编辑
起步期
在层析技术发展之初,对于一些物质的分离方式都处在比较原始的状态,并且分离的结果也并不是很理想。
bio-rad专家谈到层析技术最初是在1903~1906年由俄国植物学家M.Tswett首先提出来的。
那时,他将叶绿素的石油醚溶液倒入碳酸钙管柱,并继续以石油醚淋洗,由于碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,所以色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同的色谱图。于是就称这种混合物的分离方法为,有色的图谱法(Chromato+graphy),简称色谱法,又叫层析法。不过,当时这种方法并未引起人们的注意。
接下来随着科学技术的发展以及生产实践的需要,层析技术也得到了迅速的发展。这里就不得不提到两位在层析技术发展史上做出重要贡献的人,他们是英国生物学家马丁(Martin)和辛格(Synge)。是他们首先提出了色谱塔板理论。
色谱塔板理论其实是基于热力学近似的理论,这个理论中涉及的对象有目标分离物,色谱柱。这里色谱柱好比是一个分馏塔。理论是这样的:将目标分离物倒入“分馏塔”,这样就会在分馏塔板间移动,在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡,随着流动相的流动,组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板,并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多,则其分离效果也就越好。这个分离过程提升分离效率,并且定量的进行描述,分析这个分离过程。
这是个进步,并且马丁(Martin)和欣革(Synge)还提出更为远见卓识的预言:1、流动相可用气体代替液体,因为与液体相比,分离时候,物质间作用力更小,对分离也就更有好处。2、若能够使用非常细的颗粒填料,并在色谱柱两端施加较大的压差,从而增加了理论培板数,这将会大大提高分离效率。
发展期
上世纪60、70年代是色谱/层析技术快速发展的时代,首先是层析介质有了飞速的发展,各种人工合成的介质出现,如硅胶、聚苯乙烯二乙烯基树脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等树脂或凝胶的出现,极大地拓展了层析技术的应用领域和范围,基于不同介质的层析方法也如雨后春笋般不断涌现。
现代层析法特点
色谱法或是层析法是简单点说,就是依据被分离物的物理、化学及生物学特性的不同,使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。
[1]